转录组测序

服务简介

       全转录组是指特定细胞在特定状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA（non-coding RNA），针对非编码RNA的研究主要集中在具有调控作用的miRNA，lncRNA和circRNA。

       基于高通量测序的RNA测序（RNA-Seq）是一种高度灵敏和准确的检测全转录组表达的工具，研究人员可以在单次分析中同时分析同一样本中的mRNA，miRNA，lncRNA，circRNA，检测已知的和发现新的特征，使转录本亚型、基因融合、单核苷酸位点变异和其他特征不受先验知识的限制。研究人员能够检测疾病状态、治疗反应、各种环境条件下以及一系列其他研究设计中以前无法检测的变化。全面快速地获得RNA序列和表达丰度信息，通过关联分析，还可深入挖掘生命现象背后的转录调控问题。

        靶向RNA测序则是对感兴趣的转录本表达进行高度准确且特异测定的方法，同时提供定量和定性信息，能实现表达分析、融合基因鉴定。通过对特定基因的表达谱进行分析，可以评估疾病相关的变异和表观遗传学改变。基因融合和基因表达变化分析为癌症功能相关的改变提供了特定的视角。

        Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA（tRF&tiRNA）、snRNA和snoRNA等，是一类不具有蛋白编码能力的RNA分子，能调控基因表达，在细胞生长、发育和代谢等基础生物学过程中都扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中也起着关键的作用。高通量测序技术省去了烦琐的Small RNA克隆文库构建过程，可以一次性生成上百万条Small RNA序列，无需预先假设，能够快速鉴定特定条件下表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA，以单碱基分辨率鉴定变异，同时还可以研究不同条件下Small RNA的表达差异，并可以联合转录组测序表达谱数据进行关联分析，在转录和转录后水平研究基因调控。

技术特点

（1）RNA测序

          1、不受先验知识的限制，捕捉已知的和新的特征

          2、动态范围广，基因表达的检测更加灵敏和准确

          3、适用于任何物种，即使在没有参考测序的情况下

（2）靶向RNA测序

          1、可靶向设计RNA表达集合，重点关注感兴趣的RNA序列

          2、利用定性和定量信息来实现差异表达分析、等位基因特异的表达测定和融合基因验证

          3、兼容低质量或FFPE来源的RNA样品

（3）小RNA测序

          1、一次性生成上百万条Small RNA序列，涵盖miRNA、piRNA、tsRNA、snRNA和snoRNA

          2、无需预先假设，能够快速鉴定特定条件下表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA

应用领域

       通过新转录本预测、可变剪切分析、融合基因分析、SNV/InDel注释分析、癌基因注释等基因结构水平分析，对癌症功能相关信号通路基因进行研究；通过差异基因分析、GO/KEGG富集分析、蛋白互作网络分析、转录因子注释等基因表达水平分析，评估癌症相关的变异和表观遗传学改变。

样本要求

       样本类型：新鲜冻存组织、FFPE样本、血液样本等

服务周期

       自收到样本到交付*****个自然日

服务流程

       接收样本——RNA提取——文库构建——PE150测序——信息分析

信息分析项目

      基因结构水平分析：与参考基因组比对、新转录本预测、可变剪切分析、SNP/InDel注释分析、融合基因分析、癌基因注释等；基因表达水平分析：RNA-seq整体质量评估、差异基因分析、GO/KEGG富集分析、蛋白互作网络分析、转录因子注释等。

1、原始数据质控

       以原始数据为研究对象，对于低质量序列，未检测序列，接头序列进行过滤，并对于过滤前后数据的碱基质量、GC含量、长度分布、接头留存和Duplication比率等指标进行分析。

2、RNA基因组比对（RNA Mapping）

       采用Hisat2/Mapsplice/Star/Tophat2等算法进行基因组比对，得到基因组比对的bam文件，并基于bam文件进行信息统计，得到基因组比对率、reads在基因结构和染色体上的分布结果。

3、表达量统计（Expression）

       采用HTSeq以及基因组注释的gff3文件，根据单端或双端测序类型，选择RPKM或FPKM的标化方式对基因表达量进行统计。基于统计结果，分析得到样本间相关性、 RPKM/FPKM密度和丰度等分析结果，反映单个样本基因表达水平分布和离散程度，以及不同样本整体基因表达水平的差异。

4、差异基因筛选（Dif Gene Analysis）

       采用DESeq2/DESeq/EBSeq/EdgeR/Limma等算法进行差异筛选，得到满足差异倍数（Fold Change）以及FDR阈值的差异基因，并基于差异筛选结果以及样本的FPKM或RPKM，进行火山图分析（Volcano Plot）以及聚类图分析（Heatmap）。

5、功能分析（GO Analysis）

       采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库，对于差异基因进行功能分析，从而得到差异基因所显著性富集的功能条目（GO Term）。

6、信号通路分析（Pathway Analysis）

        整合KEGG、NCBI、EMBL等数据库，深入优化所需算法，对差异基因进行信号通路分析，得到差异基因所显著性富集的信号通路条目。

7、GO-Tree分析

        采用GO数据库中GO-term的上下级层级从属关系，进行GO-Tree绘制，得到显著性差异功能的功能簇以及层级从属关系。

8、Path-Act-Network分析

         采用KEGG数据库记载的信号通路上下游调控关系，进行Path-Act-Network绘制，得到宏观上的显著性信号通路的上下游调控关系。

9、共表达网络分析（Co-Exp-Network Analysis）高级分析

         基于GO Analysis和Pathway Analysis得到的显著性条目，以及研究者感兴趣条目，以这些条目中基因的表达值为研究目标，进行共表达网络和K-Core分析，从而得到基因间的相关性和基因的核心度，再以Co-Expression.txt和K-Core为研究对象，采用Cytoscape进行图形化展示，得到Co-Expression-Network。

10、基因间相互作用关系网络(Gene-Act-Network Analysis) 高级分析

          基于GO Analysis和Pathway Analysis得到的显著性条目，以研究者感兴趣的相关表型基因为研究对象，采用KEGG数据库基因间关系注释，帮助研究者绘制Gene-Act-Network，快速定位“核心”基因。

11、韦恩分析

           以各分组间的基因为研究对象，采用韦恩作图分析的方法，可找出各分组间共有或者特有的差异表达基因并进行深入分析。

12、趋势分析

           以各差异分组间的韦恩基因的FPKM值为研究对象，采用STEM算法，进行趋势分析，得到按照样本逻辑顺序所在趋势。

13、加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析

          基于加权的表达相关性，进行层级聚类分析，并根据设定标准切分聚类结果，获得不同的基因模块，采用聚类树的分枝和不同颜色来鉴定高度协同变化的基因集。如果有表型信息，还可以计算基因模块与表型相关性，鉴定性状相关的模块，并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定候补生物标记基因或治疗靶点。