一、CRISPR-Cas技术是什么？

CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi) 的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，      CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。

CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。

二、CRISPR-Cas9技术原理

CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列（repeat）与长度相似的间隔序列（spacer）间隔排列组成。Cas基因是一类基因家族，编码的蛋白质具有与核酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合的活性。根据Cas 基因的不同，将CRISPR-Cas9系统分为Ⅰ－Ⅲ 3种类型。在Ⅰ型 与Ⅲ型CRISPR-Cas9系统中，pre-crRNA 初级转录本被CRISPR相关RNA 酶切割成重复序列，释放小的成熟crRNA。成熟crRNA再与相关蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合体指导内切核酸酶对外源DNA 序列的识别与降解。Ⅱ型CRISPR-Cas9系统是目前最常用于人工基因组编辑的CRISPR-Cas9系统。根据Cas蛋白的类型不同分为3个亚类：Ⅱ-Ａ型含有Cas1、Cas2、Cas9 和Csn2蛋白质；Ⅱ-Ｂ型含有Cas1、Cas2、Cas4 和Csx12 样Cas9 4种蛋白质；Ⅱ-Ｃ型则有Cas1、Cas2 及Cas9３种蛋白质。其中，Ⅱ 型CRISPR-Cas9 系统最早在改造后用于小鼠和灵长类基因组编辑，是目前研究最为充分的系统。它只需要单独的Cas9蛋白即可在gRNA（guide RNA）的引导下完成对DNA的定点切割。Cas9 蛋白行使功能需CRISPR转录而来的crRNA 与反式激活的及与CRISPR重复区互补的tracrRNA（trans-activiting crRNA，tracrRNA）形成的复合物参与。

为了操作简便，研究者将crRNA和tracrRNA 融合进同一条单链中，设计出单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）。在sgRNA的指导下，Cas9定位于特定DNA序列上，进行DNA双链切割，实现基因组的定向编辑。对靶序列有效的切割还需靶序列相邻的原型间隔序列毗邻基序，即PAM（protospacer-associated motif）的参与。PAM提供两个冗余的检查点，确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理为将tracrRNA：crRNA设计为sgRNA，sgRNA包含位于５′端的靶DNA的互补序列，以及位于３′端的tracrRNA：crRNA的类似序列，crRNA 或sgRNA包含一个20nt指导序列可以直接匹配的靶位点，利用靶DNA的互补序列来定位需编辑的位点，利用tracrRNA：crRNA的类似序列与Cas9结合，实现目标基因定向基因组改造。

图1. CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理

三、CRISPR-Cas9应用

四、CRISPR-Cas9技术优势

1. 效率高：可精确编辑基因组，编辑效率高；

2. 周期短：构建和使用极为方便，极大降低了实验难度，缩短实验周期；

3. 广谱性：无基因、细胞及物种限制；

4. 多重编辑能力：可实现多个靶位点同时进行基因打靶；

5. 功能丰富：可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因.

五、CRISPR-Cas9基因编辑服务步骤

六、服务项目周期

编号	项目内容	周期（周） 注：周期为工作日
1	sgRNA的设计与构建 （设计8条sgRNA序列）	1
2	sgRNA的筛选	2
3	载体构建 注：sgRNA串联几个待定，需要等筛选结果	3
4	转染目标细胞系，qPCR方法检测载体活性	1
5	病毒包装	3
交付内容：一个病毒和两个筛选报告		合计：10

概述

CRISPR/Cas9系统是一种由RNA引导Cas9蛋白对靶基因进行修饰的技术。将Cas9中切割域突变，就会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性，但不影响其与DNA的结合能力，这种失去DNA切割活性的Cas9蛋白被命名为 Dead Cas9（dCas9） 。利用gRNA介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将dCas9蛋白与具有转录激活功能的蛋白结构域融合，可构建具有转录激活活性的系统，简称CRISPRa。

与传统转基因相比，CRISPRa系统是通过激活细胞内源基因表达来提高目标基因的表达量，它不需要转入外源DNA，降低了由于转基因造成的基因组不可逆转突变的风险。另外结合gRNA文库，可同时激活多个基因的转录与表达。此前Gain-Of-Function筛选主要是通过cDNA文库实现，但由于部分cDNA克隆难度较大致使cDNA文库覆盖率不完全；同时cDNA文库并不能涵盖每个基因的所有转录本；基因的表达也会受到细胞内部元件的调控。利用dCas9-VP64-gRNA系统进行的高通量筛选可在同一个启动子上设计多个gRNA来提高基因的转录活性，基因转录本也会更为全面。已有研究表明，利用CRISPR/Cas9系统选择性的上调基因表达，可以用来诱导干细胞的分化或重编程、刺激组织再生、补偿遗传缺陷、激活已经失活的抑癌基因、进行基因功能筛选以及合成基因回路。

技术原理

CRISPR/Cas9系统转录激活原理：dCas9与转录活化域VP64/VPR融合，表达的融合蛋白在gRNA介导下结合到启动子区，并通过VP64/VPR激活区域与PolII结合，激活基因的转录。

解决方案

枢密科技可实现单个或多个基因的转录激活，也可以通过gRNA文库，实现全基因组的转录激活调控，用于基因功能的研究及靶基因的筛选。

服务流程

实验方案及报价

方案一：Crispr/dSaCas9转录激活系统-AAV

编号	项目内容	操作方法	周期（周）
1	sasgRNA的设计与构建	AAV-U6-sasgRNA-CMV-SV40-NLS- saCas9-NLS-Flag-WPRE	1
	设计8条sasgRNA序列，位置ATG上游0-400bp
2	sasgRNA的筛选	在B16细胞上进行筛选，最终选出有 效序列2-4条	2
3	转录激活载体构建	AAV-CMV-NLS-dSaCas9-NLS-V64- U6-sgRNA	3
	注：sgRNA串联几个待定，需要等筛选结果
4	qPCR方法转录激活验证	质粒转染，收细胞，内参GAPDH	1
5	病毒包装	病毒包装，纯化，滴度检测	3
合计  注：周期为工作日			10
交付内容：一个病毒和两个筛选报告

价格可联系销售人员咨询，欢迎前来询价。

方案二：Crispr/dSaCas9转录激活系统-Lentivirus

编号	项目内容	操作方法	周期（周）
1	sasgRNA的设计与构建	LV-U6-sasgRNA-CMV-SV40 NLS-saCas9-NLS-Flag-P2A-Puro-T2A-EGFP-WPRE	1
	设计8条sasgRNA序列，位置ATG上游0-400bp
2	sasgRNA的筛选	在B16细胞上进行筛选，最终选出有 效序列2-4条	2
3	转录激活载体构建	LV-CMV-NLS-dSaCas9-NLS-VPR- U6-sgRNA	3
	注：sgRNA串联几个待定，需要等筛选结果
4	qPCR方法转录激活验证	质粒转染，收细胞，内参GAPDH	1
5	病毒包装	病毒包装，纯化，滴度检测	3
合计  注：周期为工作日			10
交付内容：一个病毒和两个筛选报告

价格可联系销售人员咨询，欢迎前来询价。

注意：方案一中AAV（腺相关病毒载体）的载量为4.7kb，因此质粒中转录激活结构域选择片段大小为150bp的VP64；方案二中LV（慢病毒载体）的载量为6kb，因此质粒中转录激活结构域选择片段大小为1569bp的VPR（VP64, p65, and Rta )；但是相关文献显示VP64对蛋白过表达的效果不佳，因此可按照需求选择其中一种病毒载体进行后期实验操作。

简介

CRISPR/Cas系统是目前被广泛的运用的基因编辑系统，其中，最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，而CRISPR/Cas13d是目前最新的VI-D类靶向RNA的CRISPR/Cas系统。Cas13d蛋白与之前发现的Cas13a/b/c相比蛋白更小，这种尺寸使其更容易包装到容量较小腺相关病毒（AAV）载体中。

通过设计sgRNA（short guide RNA)，以引导CasRX（Cas13d的一种）蛋白在对RNA的定点切割，造成RNA的降解，达到抑制基因表达的目的。由于CRISPR/Cas13d系统不借助细胞体内的RISC(RNA介导的沉默复合物，shRNA干扰的核心结构)，使其不仅能高效干扰细胞质RNA，而且能高效的干扰核内RNA（lncRNA等），补充了shRNA在核内RNA干扰上的不足。

通过突变CasRx，得到失去了催化活性但保留了RNA结合活性的dCasRx，可用于介导mRNA选择性剪接。

应用

CRISPR/Cas13d：lncRNA（long non-coding RNA）、Pre-mRNA、mRNA等细胞质和细胞核内RNA的高效和高特异性干扰。

技术优势

1. CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA特异性更强，脱靶率极低；

2. CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA干扰效果更好并且稳定性更高，适应范围更广；

3. CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA一个载体能同时干扰多个基因；

4. CRISPR/Cas13d相比shRNA/siRNA不仅可以干扰细胞质RNA，还可以干扰核内RNA；

5.无PAM序列限制的sgRNA，拥有更多的可选择靶向位点

服务内容

1. CRISPR/Cas13d干扰载体构建服务

2. CRISPR/Cas13d干扰腺相关病毒（AAV）包装服务

3. CRISPR/Cas13d干扰慢病毒包装以及干扰稳转细胞系的构建服务

服务流程

客户提供

1.干扰的目的基因模板（质粒/菌液）或基因序列（序列/ID）以及物种来源

2.病毒类型选择以及要求

3.血清型选择

案例展示

1.Salk生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)的Konermann等人研究发现，CasRx在哺乳动物细胞中能够很好地发挥功能。同时还将CasRx与shRNA干扰、dCas9介导的转录抑制（CRISPRi）敲低进行比较。结果发现，CasRx是对编码和非编码的RNA抑制效果最明显，其敲低效率为96%，shRNA干扰为65%，而CRISPRi为53%。此外，与shRNA干扰相比，CasRx也表现出对RNA干扰具有极高的特异性，为零脱靶，而shRNA处理产生500-900个明显的脱靶。

图2 CasRx介导特异和高效干扰多种人类编码和非编码RNA(Konermann et al., 2018, modified)

2. Konermann等人测试了dCasRx通过外显子跳跃操控RNA剪接的能力。以编码痴呆相关tau蛋白的MAPT基因为研究对象，导入dCasRx实现MAPT选择性剪接。通过AAV载体导入iPS衍生的皮质神经元之后，dCasRx（无催化活性，但保留了RNA结合活性）介导的外显子跳跃明显地调整了致病性与非致病性tau的比例，展示了dCasRx拥有非常好的临床应用前景。

图3 AAV病毒传递dCasRX进行选择性剪接(Konermann et al., 2018, modified)

1. Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N.J., Oki, J., Shokhirev, M.N., and Hsu, P.D. (2018). Transcriptome engineering with RNA-targeting type VI-D CRISPR effectors. Cell 173, 665-676 e614.

2. Yan, W.X., Chong, S., Zhang, H., Makarova, K.S., Koonin, E.V., Cheng, D.R., and Scott, D.A. (2018). Cas13d is a compact RNA-targeting type VI CRISPR effector positively modulated by a WYL-domain-containing accessory protein. Molecular cell 70, 327-339 e325.