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点突变

点突变

简介

      CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas)系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统,此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来,能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中,进行有效的靶向编辑,具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。

      CRISPR/Cas9系统中sgRNA(short guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂,通过细胞内的同源重组修复方式,将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中,从而实现基因敲入。

CRISPR/Cas9基因敲入示意图(Eric Murillo-Rodríguez et al., Sleep and Vigilance, 2018)

      将同时包含Cas9和gRNA序列的质粒载体与携带点突变的Donor载体(Oligo)共转入细胞核,Cas9和gRNA的复合物会引起靶位点DNA双链断裂,而后细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复,将目标点突变重组到基因组靶位点。Cas9和gRNA的质粒载体携带抗性基因,可进行药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序,筛选出点突变纯合的阳性克隆。


图1.点突变方案

图2.点突变载体

服务流程


应用

      1、细胞疾病模型造模

            通过HDR,携带点突变序列的donor oligo (ssODN)替换WT对应的碱基。

      2、细胞疾病模型修复

            通过HDR,携带WT序列的donor oligo (ssODN)替换对应的突变碱基。

参考文献

      [1]Eric Murillo-Rodríguez, Rocha N B , André Barciela Veras, et al. The End of Snoring? Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing for Sleep Disorders[J]. Sleep and Vigilance, 2018, 2(1):1 3-21.





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