二十世纪八十年代以来, 基因治疗已经应用到许多眼部疾病的研究中。腺相关病 (adeno-associatedvirus, AAV) 载体作为基因转移载体具有安全性好、宿主范围广、免疫原性低和携带的治疗基因长期表达等优势而成为眼病基因治疗研究的热点, 部分研究已进入临床试验 阶段。与其它器官相比，眼睛作为小器官有着独有的优势，例如所处的环境相对封闭，远离其他组织，减少交叉感染风险；眼部基因治疗的靶器官大部分是终未分化细胞，减少了诱发肿瘤的风险；AAV可以感染多种眼部细胞，包括光感受器、视网膜色素上皮细胞、米勒细胞、视网膜神经节细胞等。AAV对眼部细胞的转染较稳定，可转染分裂细胞和非分裂细胞，且在眼部的免疫反应较弱，具有较强的优势。

目前大约有2%与基因治疗相关的临床试验聚焦于眼科疾病，主要是各种类型的视网膜营养不良（如Leber先天性黑朦，无脉络膜症，Stargardt黄斑变性），先天性聋视网膜色素变性综合征1B（亚型USH1B）和MERTK基因突变相关的视网膜色素变性等）。其它疾病包括年龄相关性黄斑变性，Leber遗传性视神经病变，青光眼，糖尿病黄斑水肿（DME）和黄斑毛细血管扩张2型。

除了RPE65基因治疗Leber先天性黑朦, 大部分眼科基因转移研究都还没有进入3期临床试验。通过腺相关病毒载体的视网膜下注射从而替代RPE65基因已经取得满意效果，能同时提高视力和改善视网膜功能。

图1 用于治疗遗传性视网膜疾病的基因治疗方法

1. AAV可以用来构建眼科相关疾病的疾病模型

案例1：研究人员通过在老鼠视神经节细胞注射衣壳突变的AAV2携带CRE重组酶来构建组织特异性的Rosa26 (R26) 转基因小鼠，用来研究RGC退行性疾病以及视神经疾病。109的AAV病毒量就能够有效的感染鼠神经节细胞层神经元，并且可以持续表达长达11 weeks。 CRE的表达对RGC早期5 weeks内没有显著影响，但往后细胞会出现死亡。结果显示这项技术对于建立短期的疾病模型用于研究青光眼以及视神经相关疾病具有很好的应用价值。

图1 用于治疗遗传性视网膜疾病的基因治疗方法

图2 AAV2表达的外源基因在GCL视神经内部的初始表达和可持续表达效果

案例2：研究人员通过在SD大鼠视网膜下间隙注射携载有VEGF的AAV载体，诱导建立脉络膜新生血管（CNV）模型。VEGF在视网膜和视网膜色素上皮细胞可持续表达20个月，有利于模拟视网膜变性疾病的慢性病理过程。组织切片观察显示强烈的视网膜下新生血管的形成，光感受器变性以及色素上皮增殖，CNV的生成率达95%。

图2 SD大鼠眼感染了AAV-VEGF和AAV-GFP后15个月检测VEGF和GFP的表达

图2 AAV-VEGF感染SD大鼠诱导了CNV

2. AAV介导的基因替代疗法

案例1：早在2001年研究人员通过将rAAV2-RPE65注入RPE65基因敲除狗的视网膜下腔, 成功的恢复了狗的视力。

图9 四只RPE65突变的转基因狗进行基因治疗的具体过程与信息

图9 通过视网膜注射AAV-RPE65改善了RPE65突变狗的视网膜和视功能

案例2：Dalkara等建立一种AAV的变体ShH10，通过视网膜色素变性小鼠模型，以玻璃体内注射的给药方式靶向神经胶质细胞，产生高水平的胶质源性神经营养因子（GDNF），对其功能改善可维持长达5个月。

图2 shH10.Y445F.sccAG-GFP 在s334-4ter小鼠视网膜注射后在Müller细胞中观察到具有很强的全视网膜表达效果

3. AAV在眼科疾病中介导的基因干扰或基因编辑

案例1：老年黄斑变性(AMD)会影响视网膜病变，导致视力模糊扭曲，还会导致视野中央出现黑点。CRISPR-Cas9能够在基因中的特定位置进行精准地剪切和修复。研究团队成功地将CRISPR-Cas9注射到患湿性老年黄斑变性的小鼠眼中，并修改了VEGF基因。他们通过观察脉络膜新生血管(CNV)的方式监控眼部疾病进程，CNV是视网膜和巩膜之间新形成的血管，它是湿性黄斑变性的常见问题，研究人员发现，CNV区域减少了58%。此外，锥体机能不良的副作用只持续了3天，在治疗后一个星期后没有再出现。

图5 AAV 携带的CjCas9 和 sgRNA以及介导的体内以及体外突变

图5 AAV表达的外源cjCas9靶向Vegfa和Hif1a减少了激光诱导的脉络膜新生血管区域

案例2：RhoA是MAPK上游的重要信号转导分子，参与细胞骨架、粘附的调控以及多条信号通路。Koch等采用大鼠视神经夹伤模型，玻璃体内注射AAV-RhoA-shRNA, RhoA表达下调，RGCs存活率及轴突再生能力显著提高。

图7 AAV-RhoA-shRNA的载体结构图及体外表达显著下调RohA的蛋白表达水平

图8 视神经挤压后敲降RohA的表达促进了轴突末端的再生

图8 视神经切断后敲降RohA的表达促进了视网膜结细胞RGCs的存活

4. AAV用于解析眼科疾病发病机理

案例1：SOCS-3是细胞因子信号转导抑制蛋白，对多种细胞因子和激素产生的信号转导过程进行负调节。孙等将PTENf/F/SOCS3f/f小鼠视神经夹伤，玻璃体注射AAV-Cre同时敲除PTEN和SOCS3基因，并向玻璃体中添加外源性睫状神经营养因子CNTF，再生的轴突可生长到上丘，并增加了RGCs的存活。

图8 通过注射AAV-cre后敲除PTEN和SOCS3基因，在视损失后4周观察到PTEN和SOCS3基因对于轴突再生具有协调作用

图9 通过注射AAV-cre后敲除PTEN和SOCS3基因，对于视神经的再生具有协调作用且以一种延迟处理的模式进行表达

5. AAV应用于临床试验

案例1：力损害、眼球震颤及异常的眼底表现等；小部分患者发病年龄稍晚，以夜盲为主要表现，也称早发严重视网膜营养不良（severe early-childhood-onset retinal dystrophy, SECORD）。RPE65基因突变在LCA中占到6%~16%，SECORD中占到约2%，RPE65基因替代疗法已经在鼠类和犬类中试验成功。该研究则是将表达RPE65基因的重组腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体视网膜下注射以观察其安全性和有效性。

图11 12名患者表达RPE65基因的AAV视网膜下注射位置

图12 208、209号患者治疗前后动态视野检查变化情况，目标眼用Px标注，可见盲点范围缩小和阈值敏感度提高

图13 204号患者治疗前后ERG变化情况，目标眼为右眼，红色为治疗前，蓝色为治疗后

启动子名称	特性
CMV	广谱性启动子
CBA	广谱性启动子
CAG	强启动子，广谱性启动子
Rpe65	RPE--视网膜色素上皮层特异性表达
VMD2	RPE--视网膜色素上皮层特异性表达
RPGR	RPE--视网膜色素上皮层特异性表达
IRBP	Photoreceptor --感光细胞特异性表达
hGRK1	Photoreceptor --感光细胞特异性表达
CAR	Cone--视椎细胞特异性表达
RHO	Rod--视杆细胞特异性表达
Grm6	bipolar -双极细胞特异性表达(常用于光遗传学靶点）
GFAP	穆勒神经胶质细胞特异性表达
human connexin 36	黄斑中心凹双极神经节细胞特异性表达
U6	基因编辑

目前应用于眼部基因转移的AAV至少有9种血清型,它们主要区别在衣壳蛋白的不同,并因此导致各种血清型AAV对不同的组织和细胞有不同的感染效率。

无论在大鼠视网膜下或玻璃体内注射AAV1, AAV2, AAV5载体均可有效转染光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞。

AAV2, AAV5表达部位位于光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞,而AAV1则特异集中于视网膜色素上皮细胞层。

AAV5在视网膜的表达早于AAV2,并且感染效率和表达水平要高于AAV2约30倍左右。

AAV2/9载体能有效转染Muller细胞, AAV2/7载体和AAV2/8载体对小鼠光感受器的转染效率比AAV2/5高6~8倍。

AAV1载体和AAV8载体对兔或人角膜上皮的转染效率高于AAV2, AAV5和AAV7。